ИСКУССТВЕННЫЕ АЗОТИСТЫЕ ОСНОВАНИЯ МАРКИРУЮТ ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК

ИСКУССТВЕННЫЕ АЗОТИСТЫЕ ОСНОВАНИЯ МАРКИРУЮТ ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК

Мутации ДНК могут стать причиной множества заболеваний, включая онкологические. Тем не менее, к тому моменту, когда исследователи могут идентифицировать мутацию ДНК, химическое воздействие, вызвавшее мутацию, уже сложно отследить. Как отмечает Синтия Берроуз (Cynthia J. Burrows) из Университета Юты, решить проблему мог бы способ секвенирования «модифицированных» молекул ДНК и поиск происхождения мутаций.

К сожалению, поврежденные в результате мутагенных процессов нуклеотиды блокируют ферменты, необходимые для амплификации ДНК, предшествующей определению ее первичной структуры. Берроуз и ее коллеги нашли способ обойти этот барьер в изучении мутированных ДНК, разработав метод, позволяющий проводить амплификацию дефектов ДНК и их изучение. Использованный исследователями подход заключается во введении в ДНК меток – синтетических азотистых оснований, совместимых с полимеразо-цепной реакцией (ПЦР).

Для маркирования и локализации повреждений ДНК (красные) исследователи использовали синтетические нуклеотиды (синие и зеленые), совместимые с ПЦР. Анализ копированной ДНК проводится с помощью секвенирования через нанопоры белка. (Рисунок: © Aaron Fleming/U Utah)

На первом этапе работы исследователи использовали ферменты, участвующие в процессе эксцизионной репарации ДНК – ферменты, распознающие повреждение цепи ДНК и вырезающие его из цепи (строение этих ферментов позволяет определить тип повреждения ДНК).

На следующем этапе Берроуз с соавторами заполнили полученные бреши в ДНК гидрофобными синтетическими основаниями, разработанными в группе Флойда Ромесберга (Floyd Romesberg). Как отмечает Берроуз, исследователи просто брали один нуклеотид в относительно высокой концентрации и фермент-полимеразу. Такие условия вынуждали полимеразу инкорпорировать в ДНК синтетический нуклеотид, даже несмотря на то, что он не соответствовал комплементарно азотистому основанию цепи ДНК, расположенному напротив бреши, оставшейся после выщепления мутировавших нуклеотидов.

Следующий этап работы заключался в простой амплификации полученного дуплекса ДНК методом ПЦР. Включение в структуру ДНК второго синтетического азотистого основания, полностью комплементарного первому, позволяло получать большое количество копий ДНК с комплементарной парой синтетических нуклеотидов.

На заключительном этапе исследования химики из Юты взяли эти копии ДНК и с помощью секвенирования через нанопоры белка идентифицировали положение синтетических азотистых оснований, что позволило им локализовать первоначально поврежденные участки. Для удобства детектирования синтетических азотистых оснований они были модифицированы краун-эфирами, модулировавшими прохождение анализируемых объектов через нанопоры белка.

Как отмечает Шана Штурла (Shana J. Sturla) из Технического Института Цюриха, разнообразие вариантов повреждения ДНК и их низкая концентрация в пределах генома делает почти нерешаемой проблемой обнаружение и изучение этих повреждений. Она добавляет, что разработка умного подхода, сочетающего различные энзимологические и химические приёмы, позволит найти, отметить, амплифицировать и изучить такие повреждения. Швейцарская биохимик, которая и сама изучала проблему обнаружения дефектов в структуре ДНК, отмечает, что подход Берроуз может сделать невозможное возможным.

Источник: Nat. Commun. 2015, DOI: 10.1038/ncomms9807